我們都知道，ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。

在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：
（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；
（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；
（3）酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情
況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。

用于檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：

雙抗體夾心法測(cè)抗原
　　雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原*常用的方法，操作步驟如下：
1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2） 加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。     
　　洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3） 加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合
　　的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。
　　在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
AFP、hCG等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合
物而建立此法。如抗體的來(lái)源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體*好分別取自不同種屬的動(dòng)
物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相
載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)
抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測(cè)。
　　在一步法測(cè)定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)
抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)
后顯色的吸光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的
吸光值相同（參見(jiàn)1.3.2，圖1-4），如按常法測(cè)讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)
象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect），因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重
時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常
增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的*高值。用
高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。
　　假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可
用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型
問(wèn)題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(gè)亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)
性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問(wèn)題。
　　雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗
體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含
有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。采用
F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體
夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)（參見(jiàn)6.2）。
　　雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小
分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。

雙抗原夾心法測(cè)抗體
　　反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)
的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需
稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采
用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。
 間接法測(cè)抗體
　　間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗
體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（見(jiàn)圖2-3）。操作步驟如下：
1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗
　　體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程
　　中被洗去。
3）加酶標(biāo)抗抗體�？捎妹笜�(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗
　　體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，
　　固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。
4）加底物顯色
　　本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包
被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。
　　間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)
果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)
生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過(guò)
E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)�？乖�中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物
質(zhì)，例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反
應(yīng)。另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬�附而影響包被效果�?br />　　間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的
特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體
上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)
（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢
測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。

競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體
　　當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特
異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體
量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純
度的，可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被
法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的
雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本
和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抗HBc 　　ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本
與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的
抗原反應(yīng)�？笻Be的檢測(cè)一般采用此法。

 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
　　小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法
進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相
抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，*后的顯色也愈淺。
小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

捕獲包被法測(cè)抗體
　　IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或
IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的
IgG抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人
IgM作為二抗，間接測(cè)定IgM抗體，必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的
干擾。在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕
獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入
抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作
用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒
（HAV）抗體的檢測(cè)模式見(jiàn)圖2-7。
　　類風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測(cè)定IgM抗體，導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。因此中和
IgG的間接法近來(lái)頗受青睞，用這類試劑檢測(cè)抗CMV IgGM和抗弓形蟲(chóng)IgM抗體已獲成功。

 ABS-ELISA法
　　ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語(yǔ)。親和素是一種糖蛋白，分子
量60000，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量
244。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分
子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，
其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生
物素分子結(jié)合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親
和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系
統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶
標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性
糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng)，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的
鏈霉親和素則無(wú)此缺點(diǎn)，在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢(shì)。由于ABS-ELISA較普通
ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多。