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解決方案
原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
點(diǎn)擊次數(shù)：3041 日期：2013/11/16 10:37:21
一、原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)原理
1、E . coli表達(dá)系統(tǒng)
E . coli是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E . coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。
2、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)
提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長(zhǎng)與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不完全相同，因啟動(dòng)子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。
二、原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程
大腸桿菌和酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)
中心合成基因（另外收費(fèi)）或者客戶提供模板(cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒等)
構(gòu)建表達(dá)載體
篩選陽(yáng)性克隆
表達(dá)優(yōu)化和可溶性分析
SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)
Western blot檢測(cè)表達(dá)（可選）
三、注意事項(xiàng)
（1）所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性；
（2）根據(jù)自己的需要選擇不同的表達(dá)載體，并注意不同的表達(dá)載體上的融合標(biāo)簽和攜帶的抗性基因，其中有些標(biāo)簽是可以去除的。
（3）構(gòu)建好的載體*好進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，保證讀碼框正確，即沒有移碼。
（4）長(zhǎng)期保存的pET重組子在高濃度甘油中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。
（5）37 ℃生長(zhǎng)常常會(huì)使一些蛋白累積形成包涵體，而30 ℃生長(zhǎng)則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白。在某些情況下，低溫（15－20℃）延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達(dá)到*大。
（6）進(jìn)行SDS-PAGE分析時(shí)，需優(yōu)化電泳上樣體積。
（7）制備多（單）克隆抗體的制備，可采用原核表達(dá)
1、E . coli表達(dá)系統(tǒng)
E . coli是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E . coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。
2、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)
提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長(zhǎng)與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。常用的有溫度誘導(dǎo)和藥物誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。不同的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)方法并不完全相同，因啟動(dòng)子不同，誘導(dǎo)表達(dá)要根據(jù)具體情況而定。
二、原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程
大腸桿菌和酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)
中心合成基因（另外收費(fèi)）或者客戶提供模板(cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒等)
構(gòu)建表達(dá)載體
篩選陽(yáng)性克隆
表達(dá)優(yōu)化和可溶性分析
SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)
Western blot檢測(cè)表達(dá)（可選）
三、注意事項(xiàng)
（1）所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性；
（2）根據(jù)自己的需要選擇不同的表達(dá)載體，并注意不同的表達(dá)載體上的融合標(biāo)簽和攜帶的抗性基因，其中有些標(biāo)簽是可以去除的。
（3）構(gòu)建好的載體*好進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，保證讀碼框正確，即沒有移碼。
（4）長(zhǎng)期保存的pET重組子在高濃度甘油中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。
（5）37 ℃生長(zhǎng)常常會(huì)使一些蛋白累積形成包涵體，而30 ℃生長(zhǎng)則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白。在某些情況下，低溫（15－20℃）延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達(dá)到*大。
（6）進(jìn)行SDS-PAGE分析時(shí)，需優(yōu)化電泳上樣體積。
（7）制備多（單）克隆抗體的制備，可采用原核表達(dá)
