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DNA顯微注射實驗技術(shù)服務(wù)
點擊次數(shù)：4441 日期：2013/12/13 10:59:25
DNA顯微注射實驗服務(wù)項目簡介
顯微注射法（microinjection）是利用顯微操作技術(shù)，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中，導(dǎo)致宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象，而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。這種技術(shù)的長處在于任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細胞內(nèi)。此法已成功運用于包括小鼠、魚、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等轉(zhuǎn)基因動物。
DNA顯微注射實驗流程
一、導(dǎo)入DNA的制備程序如下：
1） 通過在Tris/acetate/EDTA緩沖液中進行瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離待插入DNA，用5mg/ml溴化乙啶染色。
2） 為防止對插入DNA的溴化乙啶的破壞，用長波紫外光顯影。
3） 切下目的基因所在凝膠片，電泳制備目的DNA，或用Qiaex凝膠抽提試劑盒進行抽提。
4） 乙醇沉淀目的DNA。在樣品中加入1/10體積的3M乙酸鈉，混勻，再加入2-2.5倍體積無菌100%乙醇進行沉淀。
5） -200C 孵育過夜后，超速離心機10000轉(zhuǎn)/分，離心5分，收集沉淀，重懸沉淀于Elutip緩沖液。
6） 用Elutip-D微型柱對目的DNA過柱處理。
7） 按照步驟4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗與干燥過程極其重要，因為殘余的鹽和乙醇對受精卵的發(fā)育是致命的。
8） 注射緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重懸沉淀，緩沖液必須是Milli-Q純化水配制。
9） 通過熒光光度計或凝膠電泳比色法評估目的DNA的濃度。
10） 用注射緩沖液調(diào)整目的DNA的濃度在5-10ng/ul。
二、受精卵的顯微注射
1） 置凹玻片于顯微鏡下，低倍聚焦。
2） 調(diào)節(jié)持卵管，注射針與受精卵在同一視野下后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡（32X）下時位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
3） 挨近注射針到工作液或油界邊緣，稍微進入油界。在注射前，增加注射針的壓力可見DNA溶液泡在油內(nèi)形成囊狀，以此確定DNA溶液流存在。
4） 如果未見DNA溶液流，則輕輕摩擦持樣器鈍緣，漸漸的打開注射器針頭。針頭重新進入油內(nèi)確定DNA溶液流的存在。
5） 移動持卵管回到受精卵下部。通過微分驅(qū)動水壓控制系統(tǒng)使持卵管內(nèi)產(chǎn)生溫和的負壓，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必須確保受精卵基底部與凹玻片基底部輕輕接觸。注意不宜吸得過緊，否則會使卵變形，甚至會將卵吸人持卵器內(nèi)。
6） 對持卵管內(nèi)真空進行緩慢調(diào)節(jié)，使持卵管內(nèi)受精卵輕柔地旋轉(zhuǎn)，使卵內(nèi)原核位于持卵管口的遠側(cè)端。
7） 維持持卵管穩(wěn)定，使注射針的針頭緊靠受精卵的透明帶，進行調(diào)節(jié)并使針與原核處于同一平面上。用注射針依次刺破透明帶，細胞外膜，前核核膜，進入核膜內(nèi)，受精卵的透明帶易被針尖刺破，前核核膜相當有彈性，應(yīng)用不同的方法進行嘗試突破此結(jié)構(gòu)。操作時避免與核接觸損傷核仁。
8） 保持注射針位置固定，輕輕增加壓力使DNA溶液流入前核中。注射過程中可能出現(xiàn)的現(xiàn)象如下：
�、� 注射后原核將膨大到原來的兩倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射針。
�、� 一氣泡出現(xiàn)在注射針尖端，透明帶可能膨脹，表明受精卵的膜非常艱固，沒有被刺破，此時需繼續(xù)向內(nèi)進針，直到尖端進入核，同時要小心注射針尖端極易破損。
�、� 注射針壓力較大，看不到任何現(xiàn)象，可能是注射針堵塞，需換針或更換DNA溶液。
④ 若見胞質(zhì)顆粒涌出到卵黃周圍空間，說明受精卵破裂。注射過程中，發(fā)現(xiàn)卵破裂數(shù)目較多，則需更換注射針。一支注射針一般可注射5—10枚卵。
9） 用持卵器移動受精卵到凹玻片凹內(nèi)相對隔離的位置，以區(qū)分注射組與非注射組。重新安裝持卵管并進行下一組操作。
三、受精卵的輸卵管轉(zhuǎn)移
�。�1）受精卵的輸卵管注射
1）將麻醉小鼠放置于一塑料平皿蓋上，固定小鼠牙齒于皿緣以確保小鼠氣道通暢。用70%乙醇涂搽切口部位。也可預(yù)先在手術(shù)部位剔除毛發(fā)。
2）將受精卵從培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至工作液內(nèi)。因受精卵在轉(zhuǎn)移過程中在孵箱外操作，所以應(yīng)該將其從培養(yǎng)基中移到工作液中。
3） 用移卵管裝載受精卵。移卵管的正確裝載對輸卵管轉(zhuǎn)移的成功非常重要。如圖11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些許空氣制成一個小氣泡。再吸取與氣泡體積大約相當?shù)墓ぷ饕�，緊接著在吸取另外一個小氣泡。收集受精卵于盡可能小容積的工作液中，將其線形排列于移卵管中。當所有的卵被負載后，再吸取小量氣體制成小氣泡，接著吸取*終容量的工作液。氣泡將有利于對壓力進行調(diào)節(jié)，更容易使卵移動。
4） 手術(shù)暴露輸卵管復(fù)合體。如圖所示，在離中線約0.5厘米、背駝峰與后腿髖關(guān)節(jié)之間作橫行切口。仔細用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛發(fā)。捏住一側(cè)切口皮膚，鈍性分離皮下組織。移動皮膚直到腹壁神經(jīng)走行清晰可見。這時可看到腹壁下紅色卵巢或淺色卵巢脂肪墊。用眼科鑷捏住腹壁，并作約0.5厘米橫行切口，鈍性分離組織，輕輕移出脂肪墊、卵巢、輸卵管以及子宮。用彈簧夾夾住脂肪墊并保持子宮在適當位置。若子宮及子宮角頻繁滑回腹腔，在保證氣道通暢的前提下，可適當重新布置其位置。
5） 輕輕移動塑料平皿，使小鼠位于解剖顯微鏡下，適當調(diào)節(jié)顯微鏡及小鼠位置使其輸卵管卷曲部清晰可見。
6） 用眼科鑷于漏斗部透明囊膜處鈍性撕開小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部應(yīng)用腎上腺素以減少出血，并用紗布擦拭保持操作視野干凈。
7） 一旦漏斗部清晰可見，用鑷子夾持其邊緣并充分暴露漏斗管口。在避免壺腹損傷的前提下，盡可能插入移卵管。
8） 在壓力可調(diào)節(jié)的前提下，輕輕把卵吸吹進入漏斗部。氣泡可以阻止卵回流而且很容易使卵進入輸卵管漏斗管。若吹卵的壓力太大，那么移卵管口可能抵在輸卵管壁上，這時可稍微后撤移卵管再進行操作，也可能由于血塊堵塞移卵管，若這樣，則應(yīng)該吹出細胞在培養(yǎng)皿中，重新吸卵。
9） 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置將各器官重置于腹腔內(nèi)。
10）縫合切口，用小夾夾持皮膚。常用自動小夾代替縫線，這樣可以避免小鼠啃嘶縫線，切口裂開。
11）若進行雙側(cè)手術(shù)，則于另一側(cè)子宮角重復(fù)上述操作。
12）手術(shù)完成后，安置小鼠于清潔的籠中。麻醉狀態(tài)下，小型哺乳動物無法有效維持機體溫度。所以應(yīng)該注意小鼠的保溫。可以用熱墊保持其溫度直到動物蘇醒。所有的動物在回籠前20-30分可蘇醒。由于妊娠很容易使受體母鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致流產(chǎn)或食子，所以對受體母鼠必須嚴格監(jiān)護。
顯微注射的優(yōu)缺點
以顯微注射法轉(zhuǎn)外源基因沒有長度上的限制，目前已證明數(shù)百kb之DNA片段均可以成功產(chǎn)制出轉(zhuǎn)基因動物。其缺點是設(shè)備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長時間的練習，以及每次只能注射有限的細胞。這些操作中所使用的微量移液管是用毛細管拉針器(pipettepuller)來制作的，先將玻璃毛細管加熱到其熔化的溫度，再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關(guān)，它可以用于精準的移液。這種精確度可以為各種類型和任意大小的細胞提供亞皮克升級或0.1微米(micron)范圍內(nèi)的精確的、重復(fù)性良好的細胞內(nèi)和細胞旁注射。通過運用直接的水壓（壓力注射）或者不通過使用水流，而通過施加一電場來使帶電離子運動（離子電滲法），都可以獲得將微量移液管中的物質(zhì)擠噴出去的效果。
顯微注射法（microinjection）是利用顯微操作技術(shù)，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中，導(dǎo)致宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象，而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)。這種技術(shù)的長處在于任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細胞內(nèi)。此法已成功運用于包括小鼠、魚、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等轉(zhuǎn)基因動物。
DNA顯微注射實驗流程
一、導(dǎo)入DNA的制備程序如下：
1） 通過在Tris/acetate/EDTA緩沖液中進行瓊脂糖凝膠電泳從載體中分離待插入DNA，用5mg/ml溴化乙啶染色。
2） 為防止對插入DNA的溴化乙啶的破壞，用長波紫外光顯影。
3） 切下目的基因所在凝膠片，電泳制備目的DNA，或用Qiaex凝膠抽提試劑盒進行抽提。
4） 乙醇沉淀目的DNA。在樣品中加入1/10體積的3M乙酸鈉，混勻，再加入2-2.5倍體積無菌100%乙醇進行沉淀。
5） -200C 孵育過夜后，超速離心機10000轉(zhuǎn)/分，離心5分，收集沉淀，重懸沉淀于Elutip緩沖液。
6） 用Elutip-D微型柱對目的DNA過柱處理。
7） 按照步驟4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗與干燥過程極其重要，因為殘余的鹽和乙醇對受精卵的發(fā)育是致命的。
8） 注射緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重懸沉淀，緩沖液必須是Milli-Q純化水配制。
9） 通過熒光光度計或凝膠電泳比色法評估目的DNA的濃度。
10） 用注射緩沖液調(diào)整目的DNA的濃度在5-10ng/ul。
二、受精卵的顯微注射
1） 置凹玻片于顯微鏡下，低倍聚焦。
2） 調(diào)節(jié)持卵管，注射針與受精卵在同一視野下后，轉(zhuǎn)換到高倍鏡（32X）下時位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
3） 挨近注射針到工作液或油界邊緣，稍微進入油界。在注射前，增加注射針的壓力可見DNA溶液泡在油內(nèi)形成囊狀，以此確定DNA溶液流存在。
4） 如果未見DNA溶液流，則輕輕摩擦持樣器鈍緣，漸漸的打開注射器針頭。針頭重新進入油內(nèi)確定DNA溶液流的存在。
5） 移動持卵管回到受精卵下部。通過微分驅(qū)動水壓控制系統(tǒng)使持卵管內(nèi)產(chǎn)生溫和的負壓，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必須確保受精卵基底部與凹玻片基底部輕輕接觸。注意不宜吸得過緊，否則會使卵變形，甚至會將卵吸人持卵器內(nèi)。
6） 對持卵管內(nèi)真空進行緩慢調(diào)節(jié)，使持卵管內(nèi)受精卵輕柔地旋轉(zhuǎn)，使卵內(nèi)原核位于持卵管口的遠側(cè)端。
7） 維持持卵管穩(wěn)定，使注射針的針頭緊靠受精卵的透明帶，進行調(diào)節(jié)并使針與原核處于同一平面上。用注射針依次刺破透明帶，細胞外膜，前核核膜，進入核膜內(nèi)，受精卵的透明帶易被針尖刺破，前核核膜相當有彈性，應(yīng)用不同的方法進行嘗試突破此結(jié)構(gòu)。操作時避免與核接觸損傷核仁。
8） 保持注射針位置固定，輕輕增加壓力使DNA溶液流入前核中。注射過程中可能出現(xiàn)的現(xiàn)象如下：
�、� 注射后原核將膨大到原來的兩倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射針。
�、� 一氣泡出現(xiàn)在注射針尖端，透明帶可能膨脹，表明受精卵的膜非常艱固，沒有被刺破，此時需繼續(xù)向內(nèi)進針，直到尖端進入核，同時要小心注射針尖端極易破損。
�、� 注射針壓力較大，看不到任何現(xiàn)象，可能是注射針堵塞，需換針或更換DNA溶液。
④ 若見胞質(zhì)顆粒涌出到卵黃周圍空間，說明受精卵破裂。注射過程中，發(fā)現(xiàn)卵破裂數(shù)目較多，則需更換注射針。一支注射針一般可注射5—10枚卵。
9） 用持卵器移動受精卵到凹玻片凹內(nèi)相對隔離的位置，以區(qū)分注射組與非注射組。重新安裝持卵管并進行下一組操作。
三、受精卵的輸卵管轉(zhuǎn)移
�。�1）受精卵的輸卵管注射
1）將麻醉小鼠放置于一塑料平皿蓋上，固定小鼠牙齒于皿緣以確保小鼠氣道通暢。用70%乙醇涂搽切口部位。也可預(yù)先在手術(shù)部位剔除毛發(fā)。
2）將受精卵從培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至工作液內(nèi)。因受精卵在轉(zhuǎn)移過程中在孵箱外操作，所以應(yīng)該將其從培養(yǎng)基中移到工作液中。
3） 用移卵管裝載受精卵。移卵管的正確裝載對輸卵管轉(zhuǎn)移的成功非常重要。如圖11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些許空氣制成一個小氣泡。再吸取與氣泡體積大約相當?shù)墓ぷ饕�，緊接著在吸取另外一個小氣泡。收集受精卵于盡可能小容積的工作液中，將其線形排列于移卵管中。當所有的卵被負載后，再吸取小量氣體制成小氣泡，接著吸取*終容量的工作液。氣泡將有利于對壓力進行調(diào)節(jié)，更容易使卵移動。
4） 手術(shù)暴露輸卵管復(fù)合體。如圖所示，在離中線約0.5厘米、背駝峰與后腿髖關(guān)節(jié)之間作橫行切口。仔細用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛發(fā)。捏住一側(cè)切口皮膚，鈍性分離皮下組織。移動皮膚直到腹壁神經(jīng)走行清晰可見。這時可看到腹壁下紅色卵巢或淺色卵巢脂肪墊。用眼科鑷捏住腹壁，并作約0.5厘米橫行切口，鈍性分離組織，輕輕移出脂肪墊、卵巢、輸卵管以及子宮。用彈簧夾夾住脂肪墊并保持子宮在適當位置。若子宮及子宮角頻繁滑回腹腔，在保證氣道通暢的前提下，可適當重新布置其位置。
5） 輕輕移動塑料平皿，使小鼠位于解剖顯微鏡下，適當調(diào)節(jié)顯微鏡及小鼠位置使其輸卵管卷曲部清晰可見。
6） 用眼科鑷于漏斗部透明囊膜處鈍性撕開小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部應(yīng)用腎上腺素以減少出血，并用紗布擦拭保持操作視野干凈。
7） 一旦漏斗部清晰可見，用鑷子夾持其邊緣并充分暴露漏斗管口。在避免壺腹損傷的前提下，盡可能插入移卵管。
8） 在壓力可調(diào)節(jié)的前提下，輕輕把卵吸吹進入漏斗部。氣泡可以阻止卵回流而且很容易使卵進入輸卵管漏斗管。若吹卵的壓力太大，那么移卵管口可能抵在輸卵管壁上，這時可稍微后撤移卵管再進行操作，也可能由于血塊堵塞移卵管，若這樣，則應(yīng)該吹出細胞在培養(yǎng)皿中，重新吸卵。
9） 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置將各器官重置于腹腔內(nèi)。
10）縫合切口，用小夾夾持皮膚。常用自動小夾代替縫線，這樣可以避免小鼠啃嘶縫線，切口裂開。
11）若進行雙側(cè)手術(shù)，則于另一側(cè)子宮角重復(fù)上述操作。
12）手術(shù)完成后，安置小鼠于清潔的籠中。麻醉狀態(tài)下，小型哺乳動物無法有效維持機體溫度。所以應(yīng)該注意小鼠的保溫。可以用熱墊保持其溫度直到動物蘇醒。所有的動物在回籠前20-30分可蘇醒。由于妊娠很容易使受體母鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致流產(chǎn)或食子，所以對受體母鼠必須嚴格監(jiān)護。
顯微注射的優(yōu)缺點
以顯微注射法轉(zhuǎn)外源基因沒有長度上的限制，目前已證明數(shù)百kb之DNA片段均可以成功產(chǎn)制出轉(zhuǎn)基因動物。其缺點是設(shè)備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長時間的練習，以及每次只能注射有限的細胞。這些操作中所使用的微量移液管是用毛細管拉針器(pipettepuller)來制作的，先將玻璃毛細管加熱到其熔化的溫度，再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關(guān)，它可以用于精準的移液。這種精確度可以為各種類型和任意大小的細胞提供亞皮克升級或0.1微米(micron)范圍內(nèi)的精確的、重復(fù)性良好的細胞內(nèi)和細胞旁注射。通過運用直接的水壓（壓力注射）或者不通過使用水流，而通過施加一電場來使帶電離子運動（離子電滲法），都可以獲得將微量移液管中的物質(zhì)擠噴出去的效果。
