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解決方案
細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：2782 日期：2014/2/24 16:26:38
實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞融合(Cell fusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過程。人工誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。細(xì)胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺(tái)病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應(yīng)用*廣泛的是聚乙二醇，因?yàn)樗椎�、�?jiǎn)便，且融合效果穩(wěn)定。PEG 的促融機(jī)制尚不完全清楚，它可能引起細(xì)胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團(tuán)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。
主要試劑
1. 50％PEG(MW4,000)
2. Hanks 液(pH7.4)
主要設(shè)備
1. 顯微鏡
2. 離心機(jī)
3. 水浴箱
4. 刻度離心管
5. 試管
6. 載玻璃片
7. 蓋玻片
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。
2. 稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml 預(yù)熱的Hanks 液混勻制成50％的PEG 溶液。放入37℃水浴中待用。
3. 取上述10％的雞紅細(xì)胞懸液1ml 放入離心管中，再加入5ml Hanks 液混勻，然后以1,000rpm 離心5分鐘，小心棄去上清，用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散。
4. 取上述50％PEG 溶液0.5ml，在1 分鐘內(nèi)滴加到雞紅細(xì)胞懸液，邊加邊輕輕搖動(dòng)混勻。待PEG 全部加入后靜置1 分鐘左右。此全部過程都要求在37℃水浴內(nèi)進(jìn)行。
5. 緩慢滴加9ml Hanks 液以終止PEG 的作用，在37℃水浴內(nèi)靜置5分鐘。
6. 離心棄上清后，取一滴融合后的細(xì)胞懸液滴片，加蓋片鏡檢。
7. 結(jié)果觀察
在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的雞紅細(xì)胞膜融合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的雞紅細(xì)胞。
8. 融合率的計(jì)算
在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。
細(xì)胞融合(Cell fusion)，即在自然條件下或用人工方法(生物的、物理的、化學(xué)的)使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過程。人工誘導(dǎo)的細(xì)胞融合，在六十年代作為一門新興技術(shù)而發(fā)展起來。由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。細(xì)胞融合的誘導(dǎo)物種類很多．常用的主要有滅活的仙臺(tái)病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和電脈沖。目前應(yīng)用*廣泛的是聚乙二醇，因?yàn)樗椎�、�?jiǎn)便，且融合效果穩(wěn)定。PEG 的促融機(jī)制尚不完全清楚，它可能引起細(xì)胞膜中磷脂的酰鍵及極性基團(tuán)發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。
主要試劑
1. 50％PEG(MW4,000)
2. Hanks 液(pH7.4)
主要設(shè)備
1. 顯微鏡
2. 離心機(jī)
3. 水浴箱
4. 刻度離心管
5. 試管
6. 載玻璃片
7. 蓋玻片
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 取新鮮雞血以0.85％生理鹽水制成10％的懸液。
2. 稱取0.5克PEG(MW=4,000)放入試管內(nèi)，在酒精燈上融化之，迅速加入0.5ml 預(yù)熱的Hanks 液混勻制成50％的PEG 溶液。放入37℃水浴中待用。
3. 取上述10％的雞紅細(xì)胞懸液1ml 放入離心管中，再加入5ml Hanks 液混勻，然后以1,000rpm 離心5分鐘，小心棄去上清，用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散。
4. 取上述50％PEG 溶液0.5ml，在1 分鐘內(nèi)滴加到雞紅細(xì)胞懸液，邊加邊輕輕搖動(dòng)混勻。待PEG 全部加入后靜置1 分鐘左右。此全部過程都要求在37℃水浴內(nèi)進(jìn)行。
5. 緩慢滴加9ml Hanks 液以終止PEG 的作用，在37℃水浴內(nèi)靜置5分鐘。
6. 離心棄上清后，取一滴融合后的細(xì)胞懸液滴片，加蓋片鏡檢。
7. 結(jié)果觀察
在高倍鏡下可以看到有兩個(gè)或兩個(gè)以上的雞紅細(xì)胞膜融合在一起，形成一個(gè)異核體細(xì)胞。要注意辨別融合細(xì)胞與重疊的雞紅細(xì)胞。
8. 融合率的計(jì)算
在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞(包括融合的與未融合的細(xì)胞)，以融合細(xì)胞(含兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞核的細(xì)胞)的細(xì)胞核數(shù)除以總細(xì)胞核數(shù)(包括融合與未融合的細(xì)胞核)即得出融合率。
